1.不同抗凍劑對櫛江珧和近江牡蠣精子保存效果的影響

用不同濃度的DMSO和甘油作為保護(hù)劑冷凍精子，解凍激活后檢測精子活率。其中，櫛江珧冷凍后直接鏡檢精子活率最高的是8%DMSO處理組，為60.2%；曙紅Y染色結(jié)果與鏡檢結(jié)果相吻合，即8%DMSO處理組精子活率最高，為55.6%(圖1A)。而近江牡蠣冷凍后鏡檢精子活率最高的是10%DMSO處理組(66.0%)；曙紅Y染色結(jié)果亦顯示10%DMSO保護(hù)效果**，為60.9%(圖1B)。

2.不同降溫程序?qū)苯蚝徒迪牼颖４嫘Ч挠绊?nbsp; 自增壓液氮罐

用終濃度8%和10%的DMSO分別作為櫛江珧和近江牡蠣的保護(hù)劑，檢測A、B、C、D4種不同的降溫程序的保護(hù)效果。如圖2所示，降溫程序A對精子的保護(hù)效果較差，櫛江珧和牡蠣的精子活率分別為26.1%和32.8%(直接鏡檢)；采用降溫程序B處理，櫛江珧和牡蠣精子的活率明顯上升至46.5%和55.6%(直接鏡檢)；按照降溫程序C進(jìn)行降溫后精子的活率最高，櫛江珧達(dá)到60.2%(直接鏡檢)和55.6%(曙紅Y染色)，牡蠣達(dá)到66.0%(直接鏡檢)或60.9%(曙紅Y染色)；而降溫程序D，即直接津入液氮法的保護(hù)效果最差，精子活率接近0。

3.精液稀釋方式不同對櫛江珧和近江牡蠣精子保存效果的影響

DMSO對精子存在一定的毒性，DMSO濃度過高或者作用時間過長都會增加對精子的損傷。DMSO分子滲透進(jìn)入精子的時間約為30min，在這段時間內(nèi)采取逐級升高DMSO濃度的方式稀釋精液，以減少DMSO的毒性。結(jié)果見圖3，將抗凍液等分為3份，依次與精子混合的稀釋方案對精子的保護(hù)效果**，櫛江珧鏡檢和曙紅Y染色的精子活率分別達(dá)到了63.0%和60.9%，近江牡蠣鏡檢和曙紅Y染色的精子活率分別達(dá)到了66.1%和61.8%。

4.不同平衡時間對櫛江珧和近江牡蠣精子保存效果的影響

檢測不同平衡時間對冷凍效果的影響，如圖4所示，櫛江珧和近江牡蠣精液在不經(jīng)4℃平衡時保存效果都最差，櫛江珧精子鏡檢和曙紅Y染色檢測活率分別為39.0%和34.5%，近江牡蠣為42.0%和36.7%。櫛江珧在平衡時間為15min時保存效果**，鏡檢和曙紅Y染色檢測活率分別為60.5%和54.9%，近江牡蠣在平衡時間為20min時保存效果**，鏡檢和曙紅Y染色檢測活率分別為64.5%和60.0%。利用SPSS軟件中的單因素方差法(analy-sisofvariance,ANOVA)分析發(fā)現(xiàn)，櫛江珧和近江牡蠣平衡15、20和25min的3個樣本復(fù)蘇后精子活率沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，因此4℃平衡15~25min都有利于精子的冷凍保存。

5.不同樣品體積對櫛江珧和近江牡蠣精子保存效果的影響

不同保存體積對冷凍效果存在明顯的影響，如圖5所示。當(dāng)樣品體積為0.2mL時，櫛江珧和近江牡蠣精子保存效果都是最差的，低至27.8%和31.7%(鏡檢)。櫛江珧精子活率最高的是1mL體積組，鏡檢和曙紅Y染色分別為60.0%和53.5%；近江牡蠣精子活率最高的也是1mL體積組，鏡檢和曙紅Y染色分別為63.0%和57.1%。1.4mL體積組櫛江珧和近江牡蠣精子的活率也較高，直接鏡檢櫛江珧和近江牡蠣精子活率約為56.3%和60.5%，且與1.0mL體積組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

6.不同保存時間對櫛江珧和近江牡蠣精子復(fù)蘇效果的影響 自增壓液氮罐

對同一批樣品，分別在冷凍不同天數(shù)后解凍復(fù)蘇統(tǒng)計精子活率。如圖6所示，冷凍精子與鮮精凍0d)相比精子活率明顯降低，從90%降至60%左右。其中冷凍0.5、1、7和30d組樣品間精子活率并無顯著差異(P＞0.05)；冷凍180d樣品組的精子活率略低于0.5、1、7和30d組樣品(P＜0.05)。